Detecção de Mycoplasma em culturas de células

A simple and rapid method for the detection of mycoplasmas in mammalian cell cultures has been developed on the basis of the enzymatic activity of adenosine phosphorylase. This enzyme, which has been found in high activity in mycoplasmas in contrast to mammalian cells, catalyzes the transformation of 6-methylpurine deoxyriboside (6-MPDR) into the two cytotoxic products 6-methylpurine and 6-methylpurine riboside and is the basis of an established indirect cytotoxicity test for mycoplasmas. In this study estimation of parasitic incidence relies on the direct visualization of the enzymatic conversion of 6-MPDR by isocratic ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography. The final result of the test is available after 3 to 24 h of incubation of the cells together with the indicator metabolite 6-MPDR and depends on the adenosine phosphorylase activity of the respective mycoplasma species. The direct detection of enzymatic activity results in a high sensitivity, allowing the observation of infections that could not be found by the indirect cytotoxicity test. Comparison of the direct adenosine phosphorylase activity test with other commonly used methods reveals distinct cost and time advantages. Ver artigo (Enzyme and microbial Technology) ou (Nature)

Modelos in vivo, in vitro e ex vivo para avaliar a absorção e deposição pulmonar de aerossóis

Apesar do interesse na entrega sistemática de moléculas terapêuticas, incluindo proteínas e peptídeos macromolecular através do pulmão, a avaliação Biofarmacêutica ainda é uma tarefa desafiadora do ponto de vista experimental. As abordagens in vivo, em pequenos roedores,  continuam a ser o principal esteio da avaliação, em virtude da aquisição direta de dados farmacocinéticos mais significativo, quando é dada atenção à administração reproduzível e controle da distribuição seletiva regional através de métodos mais sofisticados de administração, tais como a instilação forçada, microspray, nebulização e puff em aerosol. Uma variedade de células epiteliais do pulmão e epiteliais alveolar (AE) quando cultivadas pode oferecer uma nova oportunidade para esclarecer a cinética e os mecanismos de transporte de drogas transepitelial. Embora as linhas de células, Calu-3 e 16HBE14o, mostrarem potencial primário, modelos de cultura de células de rato e de origem humana podem ser de maior utilização, em virtude de suas junções intercelulares que discriminam a cinética de transporte de diferentes entidades terapêuticas. Enquanto isso, o modelo intermediário ex vivo de pulmão isolado perfundido (IPL) aparece para resolver as deficiências in vivo e in vitro. Este modelo ex vivo tem se mostrado ser cineticamente preditivo in vivo, no que diz respeito à disposição de macromoléculas, apesar das limitações, relativo a períodos de 2-3 h e provável ausência de circulação brônquica. Dadas as vantagens e desvantagens de cada modelo, os cientistas devem fazer a seleção adequada e atentar para o melhor modelo em cada fase do programa de investigação e desenvolvimento, proporcionando o progresso eficiente para ensaios clínicos para o futuro de entidades terapêuticas para entrega sistêmica. VER MATERIA (clique) ou (clique)

Estudo comparativo de quatro probes fluorescentes para avaliação de citotoxicidade em células NK

Cytotoxicity is one of the major defence mechanisms against both virus-infected and tumor cells. Radioactive (51)chromium ((51)Cr) release assay is a "gold standard" for assessment of natural killer (NK) cytolytic activity in vitro. Several disadvantages of this assay led us to design alternative tools based on flow cytometry analysis. Four different fluorescent dyes, calcein acetoxymethyl ester (CAM), carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), Vybrant DiO (DiO) and MitoTracker Green (MTG) were tested for labeling of NK target K-562 cells. Target staining stability, spontaneous release of fluorochromes and subsequent accumulation in bystander unstained cells were measured using fluorimetry and flow cytometry. Healthy donor peripheral blood mononuclear cells and affinity column purified NK cells were used as effectors coincubated with target K-562 cells at different E:T ratios for 3h and 90 min, respectively. Fluorescent probe 7-amino-actinomycin D was used for live and dead cell discrimination. Bland-Altman statistical method was applied to measure true agreement for all CAM-(51)Cr, CFSE-(51)Cr, DiO-(51)Cr and MTG-(51)Cr pairs analyzed. Based on the data, none of the four proposed methods can be stated equivalent to the standard (51)Cr release assay. Considering linear relationships between data obtained with four fluorochromes and (51)Cr release assay as well as linear regression analysis with R(2)=0.9393 value for CAM-(51)Cr pair, we found the CAM assay to be the most closely related to the (51)Cr assay.

ver matéria (sciencdirect)

Receptores nucleares e co-ativadores da transcricão genica em doencas inflamatórias

A regulação espacial e temporal da expressão gênica é um meio importante através onde células respondem aos sinais fisiológicos ou do meio ambiente. Fatores de transcrição que se ligam ao DNA, co-reguladores da transcrição que não se ligam ao DNA e a maquinaria da RNA polimerase II são elementos capazes de modular de maneira adequada (isto é, apropriada do ponto de vista do desenvolvimento e específico para aquele estímulo) o padrão de expressão gênica. Receptores nucleares (NRs) abrangem uma superfamília de fatores de transcrição que, uma vez ativados por ligantes, podem se acoplar ao DNA e tanto ativar quanto reprimir a expressão gênica. São conhecidos hoje 49 genes que codificam receptores nucleares, incluindo alguns que ainda não tem ligantes conhecidos (NRs "órfãos"), outros cujos ligantes foram identificados somente recentememente (NRs "órfãos adotados") e os receptores de esteróides, que foram os primeiros NRs a serem descritos. Excetuando-se os receptores de glucocorticóides, cuja função sempre foi ligada à inflamação, os demais NRs foram inicialmente conhecidos por controlarem vias metabólicas, reprodutivas ou de desenvolvimento. Todavia, mais recentemente passou-se a demonstrar a importância desses fatores de transcrição na modulação do processo inflamatório, tanto em modleos experimentais quanto em pacientes. Exemplo mais conhecido é o papel dos PPARs, especialmente o PPAR³ como modulador da inflamação em doenças cardiovasculares.Os co-ativadores da transcrição gênica compartilham com os receptores nucleares não só sua localização, mas também a capacidade de controlar a homeostase e o metabolismo celular. PGC-1 ("PPAR-gamma coativator 1") é o mais estudado desses co-ativadores, devido à sua importância em doenças cardiovasculares). Ao contrário dos NRs, porém, o papel desses co-ativadores no controle do processo inflamatório ainda não foi investigado. Ver matéria 1 ou 2 ou 3

Efeito da insulina na inflamação pulmonar secundária a sepse, na ativação do gene BGK e nos receptores IR-A e IR-B

Na sepse por CLP, o LPS das bactérias Gram-negativas, contribui de forma importante para SARA, por ativação dos TLRs. Resultados recentes mostram que a capacidade fagocítica de MAs de ratos diabéticos para alvos opsonizados por IgG está diminuída em comparação com MAs de animais sadios. Portanto, a  atual hipótese de trabalho é a que insulina possa modular a inflamação e a imunidade inata no pulmão durante a sepse. Assim, estudar a intervenção da insulina na inflamação pulmonar decorrente da sepse, analisando os mecanismos moleculares (produção/liberação de citocinas, expressão de moléculas de adesão e vias de sinalização envolvidas é uma tarefa a ser alcançada. Em paralelo, deverá ser estudado o papel da insulina na imunidade inata no pulmão analisando a atividade fagocítica e microbicida dos MAs. Para tanto deverão ser avaliados: a) o número de células no lavado broncoalveolar, o leucograma e a glicemia (monitor de glicose); b) os níveis sérico de corticosterona e insulina (ELISA); c) as concentrações de citocinas (ELISA); d) a expressão de moléculas de adesão no endotélio vascular (imunohistoquímica; e) o índice fagocítico e a atividade microbicida contra K. pneumoniae dos MAs (microscopia óptica); e f) a expressão das enzimas COX-2 e iNOS, das moléculas envolvidas na sinalização intracelular e a expressão do receptor TLR-4 no pulmão (Western blot). Ver matéria íntegra

Protocolos dos anestésicos comumente utilizados em animais de pequeno porte

Boa parte das informações pertinentes a este tópico podem ser consultadas na página do Comitê de Ética em Experiemntação animal.  Para mais detalhes clique aqui:(consultar) ou (working with rats) ou DUKE

Proteinas antiinflamatorias anexina-a1 e galectina-1

A resposta inflamatória é controlada pela ação de mediadores antiinflamatórios que atuam para manter a homeostasia da resposta imunológica e prevenir a injúria tecidual. Entre os mediadores, destacamos a anexina-A1 (ANXA1) e a galectina-1 (Gal-1), proteínas que atuam como moduladores endógenos da inflamação, particularmente regulando o processo de transmigração de leucócitos, sobretudo neutrófilos. Para a ANXA1, o papel inibitório parece estar associado com a alteração da expressão ou da ativação das moléculas de adesão como a L-selectina e a integrina nos sítios de inflamação, enquanto a Gal-1 parece interagir com a integrina. No entanto, os mecanismos que envolvem a ação destas proteínas ainda permanecem obscuros. Por estas razões, será importante investigar a co-localização ultra-estrutural das moléculas de adesão, sobretudo integrina e L-selectina, com as proteínas antiinflamatórias ANXA1 e Gal-1 nos leucócitos e nas células endoteliais, utilizando um modelo in vivo de peritonite aguda induzido pelo zimosan, em diferentes tempos (0, 4 e 24 horas). Além disso, monitorar e comparar os efeitos farmacológicos do tratamento com estas proteínas sobre a expressão das moléculas de adesão, integrina e L-selectina, utilizando o método de citometria de fluxo. VER MATERIA e protocolo

Células B-1 modulam a atividade fagocítica de macrófagos in vitro via IL-10

Considerando que macrófagos são células essenciais na resposta inflamatória, foi investigado a possível influência das células B-1 sobre a atividade de macrófagos in vitro. Os resultados mostraram que macrófagos peritoneais de camundongos Xid, que são deficientes de células B-1, possuem maior índices fagocíticos quando comparados com macrófagos de camundongos wild-type. Além disso, macrófagos de camundongos Xid são capazes de produzir maiores níveis de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio quando comparados aos macrófagos de camundongos controle. Experimentos utilizando co-cultura de células B-1 e macrófagos de camundongos Xid demonatraram que células B-1 inibem a atividade de macrófagos. Porém células B-1 provenientes de camundongos KO-IL10 não são capazes de inibir a atividade de macrófagos invitro. Portanto, foi demonstrado que células B-1 modulam negativamente a atividade efetora de macrófagos in vitro via IL-10. VER MATERIA

Cicatrização sem danos colaterais

A edição da última sexta-feira, 15 de outubro, da revista científica norte-americana Science circulou com imagens consideradas inéditas de etapas do movimento de neutrófilos cercando conjunto de células mortas no fígado de camundongo. As fotografias, extraídas de filmagem realizada por quatro horas ininterruptas com equipamento de alta resolução, vão além de mera ilustração: elas possibilitaram demonstrar que, na sequência de rotas tomadas pelos neutrófilos em sua missão de proteger o organismo de infecções, uma classe de molécula atua como extraordinário farol na sinalização do local exato das células necrosadas. O presente trabalho foi desenvolvido pela equipe do Prof Gustavo de Menezes (UFMG). Ver artigo e vídeo.

Citotoxicidade: qual é a melhor opção MTT ou Timidina radioativa?

a) Timidina tiritiada b) BrdU d) Picnose (morte)



Em violeta, FORMAZAN

O MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide thiazolyl blue) é o sal tetrazolium que, após clivagem por desidrogenases mitocondriais de células, torna-se insolúvel em água pela formação de cristais de formazan e solúveis em solventes orgânicos. Em meio de cultura com células, após adição de Dimetil Sulfóxido (DMSO-solvente orgânico), o MTT, convertido em formanzan, é solubilizado e pode ser lido por espectrofotometria. Esta reação pode ser expressa em percentual de células vivas de acordo com a absorvância obtendo-se, o percentual da viabilidade celular. Para isso, após completar o período de 18 horas, a placa de cultura de células será retirada da estufa e o sobrenadante de cada poço é desprezado. Para alguns colegas essa técnica está sujeita a viés de leitura por parte do pesquisador. A timidina é um nucleosídio, que pode ser marcado com o trítio e sua incorporação ao DNA ser visualizada após emulsão sensível a esta radiação. A timidina é uma timina ligada a um anel de desoxiribose que pode ser incorporada ao DNA na fase S do ciclo celular. A revelação mostra grãos de prata, ficam incorporados ao DNA evidenciando que a célula ainda estava em divisão celular (viável). Mais recentemente, a bromodeoxiuridina, 5-bromo-2-deoxiuridina, que é um nucleosídio sintético, também tem sido usado para estudos de citotoxicidade. O BrdU pode ser incorporado ao DNA, como a timidina, e através de anticorpos sua revelação pode ser realizada. A diferença entre o MTT, a Timidina e BrdU, além do preço é o fato de ser avaliada por citometria de fluxo. VER MATERIA