Detecção de Mycoplasma em culturas de células

A simple and rapid method for the detection of mycoplasmas in mammalian cell cultures has been developed on the basis of the enzymatic activity of adenosine phosphorylase. This enzyme, which has been found in high activity in mycoplasmas in contrast to mammalian cells, catalyzes the transformation of 6-methylpurine deoxyriboside (6-MPDR) into the two cytotoxic products 6-methylpurine and 6-methylpurine riboside and is the basis of an established indirect cytotoxicity test for mycoplasmas. In this study estimation of parasitic incidence relies on the direct visualization of the enzymatic conversion of 6-MPDR by isocratic ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography. The final result of the test is available after 3 to 24 h of incubation of the cells together with the indicator metabolite 6-MPDR and depends on the adenosine phosphorylase activity of the respective mycoplasma species. The direct detection of enzymatic activity results in a high sensitivity, allowing the observation of infections that could not be found by the indirect cytotoxicity test. Comparison of the direct adenosine phosphorylase activity test with other commonly used methods reveals distinct cost and time advantages. Ver artigo (Enzyme and microbial Technology) ou (Nature)

Modelos in vivo, in vitro e ex vivo para avaliar a absorção e deposição pulmonar de aerossóis

Apesar do interesse na entrega sistemática de moléculas terapêuticas, incluindo proteínas e peptídeos macromolecular através do pulmão, a avaliação Biofarmacêutica ainda é uma tarefa desafiadora do ponto de vista experimental. As abordagens in vivo, em pequenos roedores,  continuam a ser o principal esteio da avaliação, em virtude da aquisição direta de dados farmacocinéticos mais significativo, quando é dada atenção à administração reproduzível e controle da distribuição seletiva regional através de métodos mais sofisticados de administração, tais como a instilação forçada, microspray, nebulização e puff em aerosol. Uma variedade de células epiteliais do pulmão e epiteliais alveolar (AE) quando cultivadas pode oferecer uma nova oportunidade para esclarecer a cinética e os mecanismos de transporte de drogas transepitelial. Embora as linhas de células, Calu-3 e 16HBE14o, mostrarem potencial primário, modelos de cultura de células de rato e de origem humana podem ser de maior utilização, em virtude de suas junções intercelulares que discriminam a cinética de transporte de diferentes entidades terapêuticas. Enquanto isso, o modelo intermediário ex vivo de pulmão isolado perfundido (IPL) aparece para resolver as deficiências in vivo e in vitro. Este modelo ex vivo tem se mostrado ser cineticamente preditivo in vivo, no que diz respeito à disposição de macromoléculas, apesar das limitações, relativo a períodos de 2-3 h e provável ausência de circulação brônquica. Dadas as vantagens e desvantagens de cada modelo, os cientistas devem fazer a seleção adequada e atentar para o melhor modelo em cada fase do programa de investigação e desenvolvimento, proporcionando o progresso eficiente para ensaios clínicos para o futuro de entidades terapêuticas para entrega sistêmica. VER MATERIA (clique) ou (clique)

Estudo comparativo de quatro probes fluorescentes para avaliação de citotoxicidade em células NK

Cytotoxicity is one of the major defence mechanisms against both virus-infected and tumor cells. Radioactive (51)chromium ((51)Cr) release assay is a "gold standard" for assessment of natural killer (NK) cytolytic activity in vitro. Several disadvantages of this assay led us to design alternative tools based on flow cytometry analysis. Four different fluorescent dyes, calcein acetoxymethyl ester (CAM), carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), Vybrant DiO (DiO) and MitoTracker Green (MTG) were tested for labeling of NK target K-562 cells. Target staining stability, spontaneous release of fluorochromes and subsequent accumulation in bystander unstained cells were measured using fluorimetry and flow cytometry. Healthy donor peripheral blood mononuclear cells and affinity column purified NK cells were used as effectors coincubated with target K-562 cells at different E:T ratios for 3h and 90 min, respectively. Fluorescent probe 7-amino-actinomycin D was used for live and dead cell discrimination. Bland-Altman statistical method was applied to measure true agreement for all CAM-(51)Cr, CFSE-(51)Cr, DiO-(51)Cr and MTG-(51)Cr pairs analyzed. Based on the data, none of the four proposed methods can be stated equivalent to the standard (51)Cr release assay. Considering linear relationships between data obtained with four fluorochromes and (51)Cr release assay as well as linear regression analysis with R(2)=0.9393 value for CAM-(51)Cr pair, we found the CAM assay to be the most closely related to the (51)Cr assay.

ver matéria (sciencdirect)

Receptores nucleares e co-ativadores da transcricão genica em doencas inflamatórias

A regulação espacial e temporal da expressão gênica é um meio importante através onde células respondem aos sinais fisiológicos ou do meio ambiente. Fatores de transcrição que se ligam ao DNA, co-reguladores da transcrição que não se ligam ao DNA e a maquinaria da RNA polimerase II são elementos capazes de modular de maneira adequada (isto é, apropriada do ponto de vista do desenvolvimento e específico para aquele estímulo) o padrão de expressão gênica. Receptores nucleares (NRs) abrangem uma superfamília de fatores de transcrição que, uma vez ativados por ligantes, podem se acoplar ao DNA e tanto ativar quanto reprimir a expressão gênica. São conhecidos hoje 49 genes que codificam receptores nucleares, incluindo alguns que ainda não tem ligantes conhecidos (NRs "órfãos"), outros cujos ligantes foram identificados somente recentememente (NRs "órfãos adotados") e os receptores de esteróides, que foram os primeiros NRs a serem descritos. Excetuando-se os receptores de glucocorticóides, cuja função sempre foi ligada à inflamação, os demais NRs foram inicialmente conhecidos por controlarem vias metabólicas, reprodutivas ou de desenvolvimento. Todavia, mais recentemente passou-se a demonstrar a importância desses fatores de transcrição na modulação do processo inflamatório, tanto em modleos experimentais quanto em pacientes. Exemplo mais conhecido é o papel dos PPARs, especialmente o PPAR³ como modulador da inflamação em doenças cardiovasculares.Os co-ativadores da transcrição gênica compartilham com os receptores nucleares não só sua localização, mas também a capacidade de controlar a homeostase e o metabolismo celular. PGC-1 ("PPAR-gamma coativator 1") é o mais estudado desses co-ativadores, devido à sua importância em doenças cardiovasculares). Ao contrário dos NRs, porém, o papel desses co-ativadores no controle do processo inflamatório ainda não foi investigado. Ver matéria 1 ou 2 ou 3

Efeito da insulina na inflamação pulmonar secundária a sepse, na ativação do gene BGK e nos receptores IR-A e IR-B

Na sepse por CLP, o LPS das bactérias Gram-negativas, contribui de forma importante para SARA, por ativação dos TLRs. Resultados recentes mostram que a capacidade fagocítica de MAs de ratos diabéticos para alvos opsonizados por IgG está diminuída em comparação com MAs de animais sadios. Portanto, a  atual hipótese de trabalho é a que insulina possa modular a inflamação e a imunidade inata no pulmão durante a sepse. Assim, estudar a intervenção da insulina na inflamação pulmonar decorrente da sepse, analisando os mecanismos moleculares (produção/liberação de citocinas, expressão de moléculas de adesão e vias de sinalização envolvidas é uma tarefa a ser alcançada. Em paralelo, deverá ser estudado o papel da insulina na imunidade inata no pulmão analisando a atividade fagocítica e microbicida dos MAs. Para tanto deverão ser avaliados: a) o número de células no lavado broncoalveolar, o leucograma e a glicemia (monitor de glicose); b) os níveis sérico de corticosterona e insulina (ELISA); c) as concentrações de citocinas (ELISA); d) a expressão de moléculas de adesão no endotélio vascular (imunohistoquímica; e) o índice fagocítico e a atividade microbicida contra K. pneumoniae dos MAs (microscopia óptica); e f) a expressão das enzimas COX-2 e iNOS, das moléculas envolvidas na sinalização intracelular e a expressão do receptor TLR-4 no pulmão (Western blot). Ver matéria íntegra

Protocolos dos anestésicos comumente utilizados em animais de pequeno porte

Boa parte das informações pertinentes a este tópico podem ser consultadas na página do Comitê de Ética em Experiemntação animal.  Para mais detalhes clique aqui:(consultar) ou (working with rats) ou DUKE

Proteinas antiinflamatorias anexina-a1 e galectina-1

A resposta inflamatória é controlada pela ação de mediadores antiinflamatórios que atuam para manter a homeostasia da resposta imunológica e prevenir a injúria tecidual. Entre os mediadores, destacamos a anexina-A1 (ANXA1) e a galectina-1 (Gal-1), proteínas que atuam como moduladores endógenos da inflamação, particularmente regulando o processo de transmigração de leucócitos, sobretudo neutrófilos. Para a ANXA1, o papel inibitório parece estar associado com a alteração da expressão ou da ativação das moléculas de adesão como a L-selectina e a integrina nos sítios de inflamação, enquanto a Gal-1 parece interagir com a integrina. No entanto, os mecanismos que envolvem a ação destas proteínas ainda permanecem obscuros. Por estas razões, será importante investigar a co-localização ultra-estrutural das moléculas de adesão, sobretudo integrina e L-selectina, com as proteínas antiinflamatórias ANXA1 e Gal-1 nos leucócitos e nas células endoteliais, utilizando um modelo in vivo de peritonite aguda induzido pelo zimosan, em diferentes tempos (0, 4 e 24 horas). Além disso, monitorar e comparar os efeitos farmacológicos do tratamento com estas proteínas sobre a expressão das moléculas de adesão, integrina e L-selectina, utilizando o método de citometria de fluxo. VER MATERIA e protocolo

Células B-1 modulam a atividade fagocítica de macrófagos in vitro via IL-10

Considerando que macrófagos são células essenciais na resposta inflamatória, foi investigado a possível influência das células B-1 sobre a atividade de macrófagos in vitro. Os resultados mostraram que macrófagos peritoneais de camundongos Xid, que são deficientes de células B-1, possuem maior índices fagocíticos quando comparados com macrófagos de camundongos wild-type. Além disso, macrófagos de camundongos Xid são capazes de produzir maiores níveis de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio quando comparados aos macrófagos de camundongos controle. Experimentos utilizando co-cultura de células B-1 e macrófagos de camundongos Xid demonatraram que células B-1 inibem a atividade de macrófagos. Porém células B-1 provenientes de camundongos KO-IL10 não são capazes de inibir a atividade de macrófagos invitro. Portanto, foi demonstrado que células B-1 modulam negativamente a atividade efetora de macrófagos in vitro via IL-10. VER MATERIA

Cicatrização sem danos colaterais

A edição da última sexta-feira, 15 de outubro, da revista científica norte-americana Science circulou com imagens consideradas inéditas de etapas do movimento de neutrófilos cercando conjunto de células mortas no fígado de camundongo. As fotografias, extraídas de filmagem realizada por quatro horas ininterruptas com equipamento de alta resolução, vão além de mera ilustração: elas possibilitaram demonstrar que, na sequência de rotas tomadas pelos neutrófilos em sua missão de proteger o organismo de infecções, uma classe de molécula atua como extraordinário farol na sinalização do local exato das células necrosadas. O presente trabalho foi desenvolvido pela equipe do Prof Gustavo de Menezes (UFMG). Ver artigo e vídeo.

Citotoxicidade: qual é a melhor opção MTT ou Timidina radioativa?

a) Timidina tiritiada b) BrdU d) Picnose (morte)



Em violeta, FORMAZAN

O MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide thiazolyl blue) é o sal tetrazolium que, após clivagem por desidrogenases mitocondriais de células, torna-se insolúvel em água pela formação de cristais de formazan e solúveis em solventes orgânicos. Em meio de cultura com células, após adição de Dimetil Sulfóxido (DMSO-solvente orgânico), o MTT, convertido em formanzan, é solubilizado e pode ser lido por espectrofotometria. Esta reação pode ser expressa em percentual de células vivas de acordo com a absorvância obtendo-se, o percentual da viabilidade celular. Para isso, após completar o período de 18 horas, a placa de cultura de células será retirada da estufa e o sobrenadante de cada poço é desprezado. Para alguns colegas essa técnica está sujeita a viés de leitura por parte do pesquisador. A timidina é um nucleosídio, que pode ser marcado com o trítio e sua incorporação ao DNA ser visualizada após emulsão sensível a esta radiação. A timidina é uma timina ligada a um anel de desoxiribose que pode ser incorporada ao DNA na fase S do ciclo celular. A revelação mostra grãos de prata, ficam incorporados ao DNA evidenciando que a célula ainda estava em divisão celular (viável). Mais recentemente, a bromodeoxiuridina, 5-bromo-2-deoxiuridina, que é um nucleosídio sintético, também tem sido usado para estudos de citotoxicidade. O BrdU pode ser incorporado ao DNA, como a timidina, e através de anticorpos sua revelação pode ser realizada. A diferença entre o MTT, a Timidina e BrdU, além do preço é o fato de ser avaliada por citometria de fluxo. VER MATERIA 

Antioxidantes alvos de mitocôndria protege contra infecção generalizada

A MitoQ é um antioxidante seletivamente a mitocôndrias, que protege a mitocôndria de danos oxidativos em modelos animais de estresse oxidativo. A MitoQ modula a resposta inflamatória, reduz o dano oxidativo mitocondrial, e, assim, atenua danos aos órgãos. Para esta avaliação, os autores investigaram os efeitos da MitoQ in vitro em um modelo de células endoteliais de sepse e in vivo em um modelo murino de sepse. In vitro a MitoQ diminuiu o estresse oxidativo, indicado por uma taxa mais baixa de espécies reativas de oxigênio (P = 0,01) e pela manutenção do potencial de membrana mitocondrial (P<0.005). A MitoQ também suprimiu a liberação de citocinas pró-inflamatórias a partir de células (P<0.05), enquanto a produção de citocinas anti-inflamatórias interleucina-10 foi aumentado por MitoQ (Pb0.001). Em um modelo de rato com peptidoglicano lipopolissacarídeo para avaliar a disfunção orgânica durante a sepse, o tratamento MitoQ resultou em menores níveis de marcadores bioquímicos das funções hepática e de disfunção renal aguda (P<0.05). Estes achados sugerem que o uso de antioxidantes mitocôndrias-alvo, como MitoQ pode ser benéfico na sepse. Ver artigo (FRBM)

A importância das células tronco para a saúde pública

Em 1999, as células-tronco foram eleitas “Scientific Breakthrough of the Year” (avanço científico do ano) pela revista Science. As células-tronco se apresentam como uma fonte potencialmente ilimitada de tecidos para transplante. Os programas de transplante de órgãos atendem a uma fração muito pequena dos pacientes (5% a 10% nos Estados Unidos), seja por escassez de doadores ou pela atual incapacidade de transplante de certos órgãos ou tecidos, como muscular e nervoso. O impacto econômico desta “medicina regenerativa” pode ser avaliado na Tabela 1, que mostra o custo por ano nos Estados Unidos de pacientes com diferentes doenças teoricamente passíveis de tratamento com células-tronco.O Brasil se destaca pelo grande número de testes clínicos em andamento com CTs adultas, que avaliam o uso terapêutico mais amplo destas células em diferentes doenças, incluindo doenças cardíacas, auto-imunes, como lúpus e diabetes e trauma de medula espinhal (Fi-gura 1). Estes estudos estão em andamento e os resultados preliminares indicam que pelo menos não há efeitos adversos do transplante autólogo de CTs da medula óssea. Resta ainda analisarmos se existe algum efeito terapêutico das mesmas naquelas doenças. É importante frisar que os esses tratamentos são experimentais e ainda não podem ser oferecidos à população.Finalmente, novas fontes de CTs adultas vêm sendo caracterizadas e incluem material lipoaspirado e a polpa do dente de leite. Ainda é cedo para sabermos quais dessas células cumprirão sua promessa terapêutica, mas elas ilustram o quanto ainda temos que aprender sobre os diferentes nichos de CTs no organismo adulto. Ver artigo (artigo)

Feliz Aniversário

 Parabéns a Profª Célia MMB de Castro por mais um ano de vida, desejamos todo sucesso profissional, pessoal e espiritual. Seus alunos (LIKA)

Linfotoxina derivada de linfócitos promove câncer de próstata

Nesse artigo publicado na Nature, o grupo de Karin mostra, em um modelo de tumor de próstata resistente à castração, que a apoptose das células tumorais em resposta à falta de andrógeno leva ao recrutamento de células inflamatórias, incluindo LB, ao tecido tumoral. Supreendentemente, o infiltrado inflamatório, ao invés de proteger o camundongo, promove a recidiva do tumor. Esse processo parece ser mediado pelos linfócitos B infiltrantes, pois animais RAG-/- (nos quais o tumor demora muito mais para recidivar) reconstituídos com LB – mas não com linfócitos T – são indistinguíveis dos animais WT em termos de crescimento tumoral. Os autores vão além, e mostram que o crescimento tumoral depende da capacidade dos LB de produzir linfotoxina – animais B-LTb-/-, nos quais os LB são incapazes de produzir linfotoxina, têm fenótipo de crescimento tumoral semelhante aos RAG-/-. Portanto, os linfócitos B parecem ter uma ação independente da produção de anticorpos, agindo de maneira análoga a células inflamatórias – infiltrando o tecido e produzindo mediadores inflamatórios. ver artigo (Nature) 

Fonte: SBlobi

Inflamação intestinal deve-se ao aumento de receptores de elétrons por Salmonella

Em artigo publicado na Nature, os autores nos mostram que as espécies reativas de oxigênio geradas durante a inflamação instestinal aguda reagem com compostos de enxofre (tiossulfato) para formar um novo receptor de elétrons respiratório, tetrationato. Os genes que conferem a capacidade de usar o tetrationato como aceptor de elétrons produzem uma vantagem de crescimento para a Salmonella Typhimurium sobre a microbiota concorrentes no lúmen do intestino inflamado. Os pesquisadores concluem que os fatores de virulência de S. Typhimurium induzem a produção de tetrationato, como um aceptor eletrônico novo permite que o patógeno use a respiração para competir com micróbios fermentadores no intestino. Assim, a capacidade de desencadear a inflamação intestinal é fundamental para a biologia deste patógeno causador de diarréias. Vale ressaltar que a Salmonella enterica sorotipo Typhimurium (S. typhimurium) causa inflamação intestinal aguda usando seus fatores de virulência ao invadir o epitélio intestinal e sobreviver nos macrófagos da mucosa. (ver artigo) (Artigo da Nature)

Por: André Galvão (Doutorando do LIKA)

Grupo é premiado no V Congresso Brasileiro de Células-Tronco e Terapia Celular

O trabalho de mestrado da pesquisadora Simone Fraga, apresentado pela aluna de iniciação científica Renata Raele, foi premiado com menção honrosa no V Congresso Brasileiro de Células-Tronco e Terapia Celular, realizado em Gramado-RS. A pesquisa avaliou o efeito da desnutrição neonatal sobre a contagem de células-tronco de medula óssea (CTMO) diferenciadas in vitro em osteoblastos e a capacidade de reparo ósseo em ratos adultos. A desnutrição neonatal alterou a proliferação/diferenciação in vitro e provocou danos funcionais no animal adulto, prejudicando o poder de regeneração de CTMOs diferenciadas e a capacidade de reparo/fibroplasia destes animais.

 Por: Juliana Melo (Doutoranda em Medcina Tropical)

Pesquisa e financiamento em Imunologia e Microbiologia no Brasil

 A área médica no Brasil já tem o maior número de publicações internacionalmente indexadas há algum tempo. Supera a física, tradicionalmente a nossa área de liderança, e é seguida de várias áreas das ciências biomédicas, com destaque para a biologia molecular e bioquímica. Com um fator H pouco acima de 80 e com quase 4 citações por documento, aparece a área de Imunologia e Microbiologia. Estas informações não se referem à área de Imunologia médica e alergia. Estas áreas podem ser vistas quando se observam as sub-áreas dentro da Medicina. Neste mesmo período,a imunologia clínica e alergia têm um fator H de quase 40 com 5 citações por documento. A imunologia brasileira tem uma produção científica acima da coreana ou da indiana (gráfico acima à direita), o que não é pouco. Contudo, a nossa imunologia ocupa o 13^o lugar mundial. e sua situação é melhor que a microbiologia, por isto quando da análise em conjunto o resultado não aparece tão bom. Veja abaixo a tabela do Scimago. Os dados do Scimago não coincidem, necessariamente, com aqueles encontrados no ISI (a Scopus acompanha um número bastante maior de publicações). Os dados do CNPq mostram que após um período de estagnação, os investimentos voltaram a crescer a partir de 2003. Os investimentos realizados pela DECIT do Ministério da Saúde e pelo CT-Saúde (Fundo Setorial da Saúde de 2002 a 2009, também vêm aumentando. 





Fonte: SBIblog.

A corrida do ouro: vida sintética

Foi dada a largada para a revolução da microbiologia. Após a divulgação do mapeamento do genoma humano, o grupo de pesquisa do Dr. Craig Venter, revela que foi criada a primeira bactéria sintética, com potencial de reprodução, gerado pela integração entre os conhecimentos da bioinformática, microbiologia e genética. As possibilidades de aplicação são inúmeras, desde a agricultura, indústria bioquímica, farmacêutica, medicina, até a corrida espacial. A NASA têm total interesse nessa tecnologia pois a viagem do homem até marte dependerá de novas descobertas como essa. O Dilema que se segue é: a ciência deve criar vida sintética? Quais os riscos? A corrida do ouro foi reinaugurada, caberá a socidade debater novos limites e concessões.

Por: André Martins Galvão (Doutorando do LIKA)

Aquecimento global e os microrganismos termoresistentes

O aumento da temperatura média global, aicma de 6°C, será responsável pela extinção de muitas espécies no planeta e produzirá mudanças  em todos os biomas. Antes que isso ocorra, o planeta vai se deparar com a triste realidade dos refugiados climáticos. Dentre estes refuigados estarão humanos e todos os outros seres vivos, inclusive os microorganismos. As pesqusisas em microbiologia têm investigado como podemos manipular esses microrganismos para a engenharia de tecido, produção de remédios e vacinas, aplicações na indústria, agricultura e medicina. Porém, ainda não sabemos quase nada sobre a virulência e resistência dos microrganismos termoresistentes. Estes seres serão no futuro próximo o grande problema de saúde pública e os centros de pesquisa precisam se preparar para essa realidade: o aquecimento global e os microrganismos termoresistentes.

Por: André Martins Galvão (Doutorando do LIKA)

Feliz Aniversário!

O grupo MicroBioCel gostaria de dar as boas-vindas ao mais novo integrante da equipe, André Galvão, que hoje está completando mais um aninho de vida. André, o idealizador do Blog, tem contribuído para o crescimento do grupo através de suas idéias inovadoras. Parabéns, André! Muitas felicidades e sucesso!

V Congresso Brasileiro de Células-tronco e terapia celular

Os pesquisadores do MicroBioCel estarão presentes no V Congresso Brasileiro de Células-tronco e terapia celular, que ocorrerá em Gramado-RS, de 29 de setembro a 2 de outubro de 2010. Os alunos Juliana Melo, Alice Bezerra, Thales Henrique, Guilherme Firmino e Renata Raele representarão o grupo no evento e divulgarão os resultados de seus trabalhos conduzidos sob a orientação da Profa Dra Celía Maria Machado Barbosa de Castro.

Por: Juliana Melo (Doutoranda em Medicina Tropical)

Grupo é premiado na 25ª Reunião Anual da FESBE

Os pesquisadores do grupo de Microbiologia Clínica e cultura de células apresentaram na  25ª Reunião Anual  da Federação de Sociedades de Biologia Experimental (FESBE-2010) 22 trabalhos, sendo 01 deles premiado com menção honrosa. O trabalho da Doutoranda, Rosângela Rosendo, avaliou a resposta imunológica de ratos submetidos a obesidade, encontrando um correlação entre a diminuição da resposta imune causada pelo alteração metabólica.

Por: Thays Miranda (IC do LIKA) e André Galvão (Doutorando do LIKA)